伯乐树的小孢子发生及雄配子体发育研究
摘 要：对伯乐树的小孢子发生以及雄配子体发育过程进行了研究，结果表明伯乐树的花药有四个花粉囊，花药壁结构从外到内依次为表皮、药室内壁、中层（2层细胞）和绒毡层，典型腺质绒毡层，四分体排列方式为四面型，成熟花粉粒为二细胞型。另外，在扫描电镜下观察，花粉具三沟，沟膜光滑，外壁雕纹状，极面观三裂圆形。
中国论文
关键词：伯乐树；小孢子发生；雄配子体发育
伯乐树（BretschneiderasinensisHemsl.）是我国特有的单种科植物，作为笫三纪古热带植物区系的孑遗种，在研究被子植物的系统发育和古地理、古气候等方面都有重要的科学价值[1]。该种零星分布在长江以南各省区的山区地带[2]，因长期以来破坏严重，现有母树资源稀少，结实率低，天然更困难，处于珍稀濒危的境地，先后被列为国家一级珍贵树种和国家一级重点保护野生植物[3-5]。
然而目前国内外关于伯乐树的研究报道较少，仅限于系统发育、播种繁殖、幼苗形态、木材解剖、园林应用介绍等方面[6]，而对其胚胎学研究未见报道。本实验通过对伯乐树小孢子发生和雄配子体发育及其不同发育阶段与绒毡层是花药壁的最内层的相关性进行研究，为伯乐树生殖生物学和发育生物学的研究奠定基础，为研究和保护该物种提供生殖生物学方面的依据。
1 材料与方法
研究材料采自井冈山国家级自然保护区内伯乐树野生分布居群，采取不同时期发育的花蕾，分别用FAA（95%乙醇+5%冰醋酸+5%福尔马林），2.5%戊二醛固定，4℃下保存。
常规石蜡切片，厚度6～8μ。爱氏苏木精染色，OLYMPUS BH-2型光学显微镜观察、照相。超薄切片，按时间序列取得的伯乐树花蕾，切取雄蕊（根据需要选择部位和方向剪切）2.5%戊二醛固定，国产环氧树脂618包埋，用玻璃刀LKB-V型超薄切片机上切片，铀铅双染色，HITACHI H-600电镜下观察、拍摄。花粉的扫描观察，直接将干燥花粉粘于贴有双面导电胶带的样品台上，喷金，Hitachi S-3500N型扫描电子显微镜观察并摄影。
2 研究结果
2.1 花药壁的发育
光镜下观察伯乐树的成熟花药横切面（图版Ⅰ：图3）可见：花药具4个花粉囊。早期花药有4个角隅，最外一层为表皮细胞，内为细胞核大、细胞质浓的孢原细胞。孢原细胞经平周分裂形成两层细胞，外层为初生周缘细胞，内为初生造孢细胞。初生周缘细胞经几次平周和垂周分裂形成5层细胞的花药壁（图版Ⅰ：图4），从外到内依次是表皮、药室内壁、中层和绒毡层。
根据绒毡层发育后期的形态的差别，胡适宜将其划分为腺质的和变形的两种[7]，因为伯乐树的绒毡层细胞是原位解体的，应为腺质绒毡层（图版Ⅰ：图5）。绒毡层细胞在整个发育过程中起初紧贴于中层内侧，当小孢子母细胞减数分裂时绒毡层细胞表现出强烈的分泌细胞性质，通过细胞内表面分泌各种物质提供小孢子发育的需要，绒毡层细胞的细胞质含丰富的细胞器（图版Ⅰ：图6），同时显示了有大量营养物质的储存。当小孢子四分体形成时绒毡层细胞完全脱离药壁细胞壁，逐渐开始消失但绒毡层仍维持原有的完整结构（图版Ⅰ：图7）。小孢子发育阶段绒毡层细胞开始表现出明显的解体迹象，细胞体积变小并扁平化（图版Ⅰ：图8）。在小孢子发育后期或雄配子阶段，绒毡层仅留残迹（图版Ⅰ：图9）。
2.2 小孢子的发生
初生造孢细胞不断分裂形成次生造孢细胞，其发育成小孢子母细胞。小孢子母细胞近圆形，体积较其他细胞大，细胞质浓厚，无液泡，细胞核大，核仁明显。小孢子母细胞继续发育彼此相互分开，排列不甚紧密，接着进入减数分裂期。小孢子母细胞经过减数分裂产生四个单倍性的小孢子，它们被共同的胼胝质壁包围，称为四分体。伯乐树的四分体呈四面体形（图版Ⅰ：图10）。
2.3 雄配子体的发育
小孢子从四分体释放后，进一步形成明显的壁，同时体积迅速增大新形成的小孢子有浓厚的细胞质和一个位于中央的细胞核（图版Ⅰ：图11），即为单核居中期。随着体积的增大，小孢子的细胞质发生液泡化，逐渐形成一个中央大液泡，细胞质成一薄层贴着细胞壁，细胞核随着从细胞中央移到细胞的一侧，从而进入单核靠边期（图版Ⅰ：图12）。在电镜下观察，小孢子细胞核较大，核膜及核孔都非常清晰（图版Ⅰ：图13）。
小孢子核在贴近细胞壁的位置进行有丝分裂，形成生殖核和营养核和生殖核。接着发生胞质分裂，在两核间出现一个弧形的细胞板，分隔成两个细胞（图版Ⅰ：图14）。由于分裂高度的不均等性，形成体积较大的营养细胞和体积较小、呈透镜状的生殖细胞。小孢子分裂时，外壁已十分明显，并在壁的某些区域形成萌发孔或萌发沟（图版Ⅰ：图15）。生殖细胞最初紧贴着花粉的壁，后来逐渐从花粉的内壁交界处向内推移，游离在营养细胞的细胞质中。直到散粉前，生殖细胞一直不分裂，因此，伯乐树的成熟花粉为2-细胞型（图版Ⅰ：图16）。花药成熟时纵裂，每一侧两个小孢子囊的隔壁消失而连通，花粉散出（图版Ⅰ：图17，18）。伯乐树的花粉为单粒花粉，扫描电镜下观察显示花粉粒近球形（图版Ⅱ：图19），具三沟，沟膜光滑，外壁雕纹状，极面观三裂圆形（图版Ⅱ：图20）。
在透射电镜下观察，花粉壁由外壁和内壁构成（图版Ⅱ：图21），外壁厚，覆盖层和基粒棒清晰可见，同一个花粉上有具被层的外壁，同时也有不具被层的外壁（图版Ⅱ：图22）。花粉萌发前营养细胞的细胞质中，含有较多的细胞器，储存了较多的营养物质（图版Ⅱ：图23），为花粉的萌发做好了准备。
2.4 伯乐树绒毡层与小孢子发生及雄配子体发育时期的相关变化
伯乐树的绒毡层是腺质绒毡层，成熟的绒毡层细胞为多核。伯乐树绒毡层与小孢子发生及雄配子体发育时期的相互关系如表2所示：
表2 绒毡层与小孢子及雄配子体发育时期的相关变化
3 讨论 3.1 伯乐树的胚胎学主要特征分析
通过实验观察研究结果可初步得出伯乐树的胚胎学特征为：花药有4个花粉囊，花药壁结构从外到内依次为表皮、药室内壁、中层（2层细胞）和绒毡层（1层细胞），典型腺质绒毡层，四分体排列方式为四面型。通过电镜扫描可见成熟的花粉粒为二细胞型，具三个孔沟，沟膜光滑，外壁雕纹状，极面观三裂圆形。根据前人对不同植物花粉形态的研究，认为由于花粉形态是受基因型所控制，具有保守型、稳定性和可靠性，而且花粉外壁纹饰又是花粉中最有价值的分类依据之一，故在植物分类、系统发育、起源与演化方面被广泛应用[8]。
绒毡层是花药壁的最内层，此层对小孢子或花粉的发育起重要的作用。花药发育的四分体时期是绒毡层细胞发育最为旺盛的时期，然后绒毡层细胞开始降解退化。绒毡层细胞作为花药壁的最内层，紧紧包围着小孢子母细胞，对小孢子或花粉的形成和发育起到重要的作用[9]。花粉的败育与绒毡层结构和功能异常密切相关，伯乐树绒毡层与小孢子及雄配子体发育时期的相关变化显示，绒毡层发育正常，保证了小孢子的发育。
3.2 伯乐树小孢子的发生、雄配子体的发育过程与其濒危的相关性讨论
植物种群的拓展，生命的延续是靠生殖来实现的。生殖过程中任何一个环节出现了问题，都将造成生殖失败，最终导致植物濒危[10]。小孢子、胚珠的大量败育、低效率的传粉、雌雄配子体的低效结合或畸形种子的大量产生都可能是致濒的主要原因。植物的濒危还与外界环境有很大的关系，环境因素如温度、湿度、光照、海拔等均会对植物的生长有一定的影响作用[11]。在对伯乐树不同发育时期的花进行石蜡切片和超薄切片的观察，伯乐树的小孢子发生及雄配子体发育过程中没有存在败育或其它异常现象。本研究表明伯乐树的致濒原因不在于有性生殖的上述阶段，而应该继续在雌配子体的发育、传粉、受精、种子繁育和幼苗生长等阶段寻找。
参考文献
[1]国家一级保护植物―伯乐树.
[2]1984中国植物志第34（1）卷
[3]傅立国.中国植物红皮书[M].北京：科学出版社，1992：194-195.
[4]于永福.国家重点保护野生植物名录（第一批）[J].植物杂志，1999，5：4-11.
[5]汪松，解焱.中国物种红色名录[M].北京：中国高等教育出版社，2004：336.
[6]乔琦，邢福武，陈红锋，王美娜.中国特有珍稀植物伯乐树的研究进展和科研方向[J].中国野生植物资源2011：30（3）：4-8.
[7]胡适宜.被子植物生殖生物学[M].北京：高等教育出版社，2005：36.
[8]中国科学院植物研究所古植物研究室孢粉组.孢粉学译丛[M].北京：科学出版社，1980.
[9]李婉莎，杨红玉.花药绒毡层发育相关基因的研究进展[J].安徽农业科学，2007，35（14）：4120-4123.
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[11]许小莲等，濒危植物羊角槭小孢子发生与雄配子体发育研究，植物分类与资源学报2012：34（4）：339-346.
